1型糖尿病小鼠松质骨和皮质骨骨量下降的差异及机制研究

Different degrees of reductions in bone mass of cancellous bone and cortical bone in mice with type 1 diabetes and related mechanism

摘要:

目的：研究1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）小鼠松质骨和皮质骨骨量下降差异并探讨其机制。方法：以30只8周龄C57BL/6J小鼠为对象，随机分为健康对照组（wild type，WT）和T1DM组。T1DM组通过注射链脲佐菌素（streptozo－tocin，STZ）建立1型糖尿病模型，WT组小鼠注射同等剂量生理盐水。行Micro-CT、X线扫描、HE染色与骨形态计量检测分析比较2组小鼠骨量、成骨活动的变化。通过免疫组化与实时定量聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR）检测经典Wnt/β-catenin通路相关因子，包括低密度脂蛋白受体相关蛋白-6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6，LRP-6）、β-catenin、淋巴细胞增强因子（lymphoid enhancer factor，LEF-1）、T细胞因子（T cell factor，TCF）以及成骨细胞相关转录因子包括碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、成骨相关转录因子（osterix，Osx）、成骨细胞标志物核心结合因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）的mRNA与蛋白表达水平。结果：观察2组小鼠形态学结果发现，T1DM组小鼠股骨远端骨量下降最为明显，而股骨中段骨量下降幅度较小。Micro-CT重建结果显示，T1DM小鼠松质骨指标骨体积占组织总体积百分比（BV/TV）、松质骨厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）较WT小鼠相比下降幅度较大[（0.16±0.01） vs. （1.27±0.08），（0.04±0.01） vs. （0.09±0.01），（1.90±0.27） vs. （4.53±0.45）；P＜0.01]。而皮质骨对应指标，单位体积内骨组织面积比（BA/TA）与皮质骨厚度（CT.Th）其降低幅度明显减小[（0.35±0.05） vs. （0.40±0.02），（0.17±0.01） vs. （0.18±0.01）；P＜0.05]。骨组织形态计量结果显示T1DM小鼠较WT相比松质骨单位骨面积内成骨细胞表面积比值（Ob.S/BS）、单位骨面积内骨矿化面积比值（MS/BS）、骨矿化沉积率（MAR）、骨形成率（BFR）下降幅度较大[（12.15±0.46） vs. （21.69±0.37），（30.19±1.02） vs. （38.02±0.70），（0.74 ± 0.06） vs. （1.13±0.10），（0.25±0.02） vs. （0.48±0.04），P=0.000]。而皮质骨下降幅度较小分别为[（12.80±0.13） vs. （16.41±0.29），（36.16±1.22） vs. （42.21±0.54），（0.67±0.34） vs. （0.83±0.03），（0.27±0.02） vs. （0.36±0.04）；P=0.000]。RT-PCR结果显示T1DM小鼠Wnt/β-catenin通路相关因子LRP6、β-catenin、Tcf、LEF-1与成骨分化指标ALP、OCN、OSX、Runx2的表达水平较WT组明显降低，其中松质骨下降幅度较大[（0.18±0.13） vs. （1.00±0.13），（0.23±0.20） vs. （1.00±0.15），（0.29±0.23） vs. （1.00±0.23），（0.22±0.17） vs. （1.00±0.12），（0.52±0.10） vs. （1.00±0.00），（0.52±0.11） vs. （1.00±0.10），（0.42±0.01） vs. （1.00±0.10），（0.34±0.12） vs. （1.00±0.08）；P＜0.01]，皮质骨下降幅度较小为[（0.74±0.65） vs. （1.00±0.07），（0.63±0.45） vs. （1.00±0.09），（0.75±0.58） vs. （1.00±0.08），（0.70±063） vs. （1.00±0.05），（0.67±0.19） vs. （1.00±0.23），（0.73±0.08） vs. （1.00±0.23），（0.63±0.08） vs. （1.00±0.39），（0.62±0.08） vs. （1.00±0.11），P＜0.05]。免疫组化结果与RT-PCR趋势一致。结论：T1DM小鼠松质骨骨量下降幅度较皮质骨更显著，其机制可能为Wnt/β-catenin信号通路表达水平在松质骨下降幅度更显著。

Abstract:

Objective：To investigate the different degrees of reductions in bone mass of cancellous bone and cortical bone in mice with type 1 diabetes mellitus（T1DM） and related mechanism. Methods：A total of 30 C57BL/6J mice aged 8 weeks were randomly divided into wild-type（WT） group and T1DM group. The mice in the T1DM group were given intraperitoneal injection of strep－tozotocin to establish a model of T1DM，and those in the WT group were given injection of the same dose of normal saline. Micro-CT，X-ray radiology，HE staining，and bone morphometry were used to observe the changes in bone mass and osteogenic activity. Immunohistochemistry and real-time PCR were used to measure the mRNA and protein expression of the factors involved in the Wnt/β-catenin pathway，including low-density lipoprotein receptor-related protein 6（LRP-6），β-catenin，lymphoid enhancer factor（LEF-1），T cell factor（TCF），and osteoblast-related transcription factors，including alkaline phosphatase（ALP），osteocalcin（OCN），osterix（OSX），and runt-related transcription factor 2（Runx2）. Results：According to the results of morphological examination，the T1DM group had the greatest reduction in bone mass of the distal femur and a slight reduction in bone mass of the middle femur. Micro-CT analysis revealed that compared with the WT group，the T1DM group had significant reductions in the following indices of cancellous bone：bone volume per total volume（0.16±0.01 vs. 1.27±0.08，P<0.01），trabecular thickness（0.04±0.01 vs. 0.09±0.01，P<0.01），and trabecular number（1.90±0.27 vs. 4.53±0.45，P<0.01）；as for the corresponding indices of cortical bone，compared with the WT group，the T1DM group had significant reductions in bone area per total area（0.35±0.05 vs. 0.40±0.02，P<0.05） and cortical thickness（0.17±0.01 vs. 0.18±0.01，P<0.05）. Bone mor－phometry showed that compared with the WT group，the T1DM group had significant reductions in the following indices of cancellous bone：osteoblast surface per bone surface（12.15±0.46 vs. 21.69±0.37，P=0.000），mineralizing surface per bone surface（30.19±1.02 vs. 38.02±0.70，P=0.000），mineral apposition rate（0.74±0.06 vs. 1.13±0.10，P=0.000），and bone formation rate（0.25±0.02 vs. 0.48±0.04，P=0.000）；as for the corresponding indices of cortical bone，the T1DM group also had significant reductions in these indices compared with the WT group（osteoblast surface per bone surface：12.80±0.13 vs. 16.41±0.29，P=0.000；mineralizing surface per bone surface：36.16±1.22 vs. 42.21±0.54，P=0.000；mineral apposition rate：0.67±0.34 vs. 0.83±0.03，P=0.000；bone formation rate：0.27±0.02 vs. 0.36±0.04，P=0.000）. RT-PCR showed that compared with the WT group，the T1DM group had significantly lower expression of the Wnt/β-catenin pathway factors LRP-6，β-catenin，TCF，and LEF-1 and osteogenic differentiation indices ALP，OCN，OSX，and Runx2 in cancellous bone（0.18±0.13 vs. 1.00±0.13，0.23±0.20 vs. 1.00±0.15，0.29±0.23 vs. 1.00±0.23，0.22±0.17 vs. 1.00±0.12，0.52±0.10 vs. 1.00±0.00，0.52±0.11 vs. 1.00±0.10，0.42±0.01 vs. 1.00±0.10，0.34±0.12 vs. 1.00±0.08，all P<0.01） and cortical bone（0.74±0.65 vs. 1.00±0.07，0.63±0.45 vs. 1.00±0.09，0.75±0.58 vs. 1.00±0.08，0.70±0.63 vs. 1.00±0.05，0.67±0.19 vs. 1.00±0.23，0.73±0.08 vs. 1.00±0.23，0.63±0.08 vs. 1.00±0.39，0.62±0.08 vs. 1.00±0.11，all P<0.05）. Immunohistochemistry showed a similar trend as RT-PCR. Conclusion：In T1DM mice，the reduction in cancellous bone mass is greater than that in cortical bone mass，which might be caused by the greater downregulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancellous bone than in cortical bone.